AVALIAÇÃO FUNCIONAL DA VIA TP53/TP73 NA LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA

Abstract

Embora mutações no gene supressor de tumor TP53 (TP53mut) estejam presentes em menos de 10% dos casos de leucemia mieloide aguda (LMA) do adulto, pacientes TP53mut geralmente apresentam respostas insatisfatórias ao tratamento. Em termos práticos, isso se justifica porque algumas drogas usadas nos protocolos atuais dependem da ativação da via do TP53. Entretanto, este pode não ser o único motivo. Análises preliminares do nosso grupo mostraram que um grupo de pacientes sem mutações no TP53 (TP53wt) podem apresentar um comportamento clínico semelhante aos pacientes TP53mut. Neste subgrupo, nós identificamos um aumento da expressão relativa de ΔNp73, uma das isoformas do gene TP73. Esta isoforma truncada tem origem a partir de um promotor adicional, a qual não apresenta o domínio de transativação proteína completa (TAp73). Desta forma, ela é incapaz de transcrever os genes responsíveis da via TP53/TP73, atuando de forma dominante negativa sob a via. Análise transcriptômica de pacientes adultos com LMA apresentando ΔNp73alto/TP53wt revelou um perfil transcricional similar ao perfil transcricional de pacientes TP53mut, o que inclui um status de stemness e frequência aumentada de mutações em genes relacionados a um prognóstico adverso em LMA. Validando esses achados, a expressão forçada de ΔNp73 (por meio de vetores lentivirais) também conferiu um status de stemness em células CD34+ de doadores saudáveis. Funcionalmente, células CD34+/ΔNp73alto apresentaram um aumento na taxa de proliferação celular e capacidade clonogênica. Em linhagens celulares de LMA TP53wt(MOLM13 e MV4-11), a expressão lentiviral de ΔNp73 conferiu resistência a apoptose a diferentes drogas de uso clínico. Esses resultados foram corroborados ex vivo, onde amostras de pacientes que apresentaram ao diagnóstico um padrão ΔNp73alto foram mais resistentes ao tratamento com venetoclax+5-azacitidina. Finalmente, os dados de acessibilidade da cromatina em pacientes com LMA permitiram a identificação de uma região diferencialmente acessível no íntron 2 do gene TP73 (+24Kb após o início do sítio de transcrição, referido como pico B). Por meio de técnicas de CRISPR/Cas9, geramos células MOLM13 knockout sem essa região pico B (MOLM13-KO) para avaliar se esta atuaria como uma região controladora da expressão de ΔNp73. As células MOLM13-KO exibiram expressão significativamente reduzida de ΔNp73. A perda dessa região também prejudicou a capacidade de regular positivamente a expressão de ΔNp73 após estresse induzido por drogas, sugerindo ser esta a região responsável pela expressão diferencial desta isoforma. A análise de imunoprecipitação de cromatina comprovou uma redução da ligação do ΔNp73 as regiões reguladoras da expressao de TP53 e TP73, bem como de genes alvo da via, como o CDKN1A. Como resultado da diminuição de ΔNp73, as células MOLM13-KO se tornaram mais sensíveis a estímulos apoptóticos. Em resumo, células ΔNp73alto/TP53wt apresentam assinatura genética semelhante a células TP53mut. Funcionalmente, células ΔNp73alto/TP53wt são mais resistentes a apoptose induzida por drogas e apresentam maior capacidade proliferativa. Além disso, é a primeira vez que um estudo identificou um enhancer capaz de direcionar a expressão diferencial das isoformas do gene TP73. Em combinação, nossos resultados podem ajudar a esclarecer o porquê pacientes TP53wt apresentam respostas clínicas tão heterogêneas, além de fornecer um possível alvo terapêutico para pacientes adultos com LMA.