Revista Ciência Agronômica (Jun 2010)
Validação de métodos laboratoriais aplicadas a análises com marcadores microssatélites Validation of laboratory methods applied to microsatellite markers
Abstract
A troca de informação sobre biodiversidade e a utilização de recursos genéticos podem ser melhor realizadas se os laboratórios que geram as informações puderem demonstrar que seus resultados são confiáveis através de metodologias adequadas de validação. Para definir critérios que sirvam para demonstrar a confiabilidade de resultados em laboratórios onde são realizadas pesquisas com marcadores de DNA, foram analisados erros associados à quantificação de DNA em gel de agarose e à repetitividade e robustez da reação da polimerase em cadeia (PCR) utilizando primers baseados em marcadores microssatélites (SSR). O erro associado à quantificação de DNA foi menor quando 100 ng foram quantificadas, e aumentou para quantidades de DNA maiores, com a tendência de subestimar sua quantidade. O limite de quantificação, entendido como as menores diferenças de quantidade de DNA que o método detecta, variou expressivamente com pequena variação da quantidade de DNA. A incerteza associada ao PCR foi estimada por sua repetitividade, que mostrou-se sensível à quantidade de DNA da reação. A baixa robustez da PCR quanto à quantidade de DNA demonstra a necessidade prioritária de avaliação deste parâmetro. As considerações feitas podem ser auxiliares para que laboratórios de marcadores moleculares utilizem procedimentos de validação.Biodiversity information exchange and the use of genetic resources can be improved if the laboratories are able to assure their results thought suitable methodologies of validation. Aiming to define criteria which demonstrate the reliability of results in laboratories which work with DNA markers, errors associated to the DNA quantification in agarose gel, PCR repeatability and robustness using microsatellite (SSR) markers were analyzed. The error associated to DNA quantification was smaller when 100 ng of DNA were quantified, and increased for greater amounts of DNA, tending to sub estimations. Quantification limits, or the smallest quantity detected by the method used, varied markedly with small variations on the DNA amounts. Uncertainty associated to microsatellite PCR reaction was measured by its repeatability, which was affected by the quantities of DNA in the reaction. The low robustness of the microsatellite PCR reaction due to sensibility to quantities of DNA showed the priority on evaluating this parameter. The presented methodologies may be useful to laboratories working with molecular markers implementing validation procedures.
Keywords
