Біофізичний вісник (Dec 2021)
Теоретичні підходи до визначення оптимальних режимів кріоконсервування клітинних сфероїдів різних термінів культивування
Abstract
Актуальність. Тривимірні культуральні системи — це унікальні платформи для вивчення складних біологічних процесів in vitro. Взаємодії клітина-клітина та клітина — позаклітинний матрикс утворюють комунікаційну мережу біохімічних та механічних сигналів, що наближує сфероїди (СФ) до нативних тканин і суттєво відрізняє їх від моношарових культур. Важливим для клітинних технологій є розробка способів кріоконсервування 3D-культур, що дозволить створювати запаси цінних клітинних зразків, економити час та матеріали, буде запобігати втраті культур через технічні збої, контамінацію, дрейф фенотипу та старіння. Мета роботи. Розробка підходів до кріоконсервування клітинних сфероїдів. Визначення параметрів проникності сфероїдів з клітин лінії L929 різних строків культивування для теоретичної оцінки оптимальних режимів заморожування. Матеріали і методи. У роботі були використані клітини лінії L929, які утворюють СФ різного діаметру, і можуть бути підтримані тривалий час у 3D — умовах. Для визначення інтегральних коефіцієнтів фільтрації Lp і проникності для ДМСО kp у СФ на різних строках культивування, був використаний вольюмометричний метод. Дослідження динаміки зміни об’єму сфероїдів у часі здійснювали на конфокальному мікроскопі LSM 510 META. Чисельні значення інтегральних коефіцієнтів проникності СФ визначали шляхом апроксимації експериментальних даних зміни відносного об’єму СФ від часу експозиції в досліджуваному розчині теоретичними кривими, розрахованими на підставі фізико-математичної моделі пасивного масообміну між сфероїдом і оточуючим середовищем за умови їх максимального збігу. Прогнозування осмотичної поведінки СФ в умовах охолодження здійснювали на підставі диференціального рівняння, що описує кінетику зміни відносного об’єму клітини в процесі позаклітинної кристалізації кріопротекторного розчину, підставляючи в рівняння моделі визначені величини інтегральних коефіцієнтів проникності Lp і kp та енергії активації EAL і EAk. Кінетику зміни концентрації позаклітинного розчину в процесі заморожування при розрахунках задавали аналітично шляхом апроксимації фазової діаграми плавлення розчину ДМСО. Результати. Визначені коефіцієнти фільтрації та проникності для молекул ДМСО у СФ та показано, що вони вірогідно зменшуються зі збільшенням строків культивування. Розраховані величини енергії активації проникання молекул води та ДМСО у СФ та визначена їх залежність від строків культивування. На підставі визначених параметрів проникності розрахована динаміка зміни об’єму СФ різних строків культивування за різних швидкостей охолодження. Висновки. Теоретично визначені оптимальні режими охолодження СФ з клітин лінії L929: для 7 діб культивування — 1,5–2 °С/хв з охолодженням до -80°С і подальшим зануренням у азот; для 14 і 21 доби культивування — 0,5 °С/хв до -40°С і подальшим зануренням у азот.
Keywords
