Исследование влияния рекомбинантного аполипопротеина А-I на работу сердечной мышцы в эксперименте

Abstract

Введение. Ранее установлено, что липопротеины высокой плотности плазмы крови крыс увеличивают частоту и силу сокращения изолированного сердца крысы. На этой модели основной белковый компонент липопротеинов высокой плотности аполипопротеин А-I, выделенный из плазмы крови человека, увеличивал силу сокращений сердца, мало влияя на частоту. Разработанная в НИИ биохимии методика получения рекомбинантного аполипопротеина А-I позволяет значительно расширить исследования кардиотропных свойств данного белка. Цель. Изучить влияние рекомбинантного аполипопротеина А-I на показатели работоспособности изолированного сердца крысы, сравнив его с действием нативного аполипопротеина А-I. Методы. Эксперименты проведены на крысах-самцах Вистар массой 250–300 г. Изолированные сердца крыс перфузировали ретроградно по стандартной методике с регистрацией изоволюмического давления в левом желудочке. Рекомбинантный аполипопротеин А-I человека был получен в клетках E. coli в виде химерного полипептида, с последующим превращением белка в зрелую форму рекомбинантного аполипопротеина А-I. Результаты. Показано, что рекомбинантный аполипопротеин А-I в концентрации 20 мкг/мл вызывал стабильное повышение давления в левом желудочке, при этом величина коронарного потока и частота сердечных сокращений менялись незначительно. Максимальный инотропный эффект был зарегистрирован на 20 мин от начала перфузии и составил 147,5% относительно контрольных значений. Установлено, что в присутствии рекомбинантного аполипопротеина А-I увеличивалась максимальная скорость сокращения левого желудочка. При этом временной отрезок диастолы имел тенденцию к увеличению и был больше, по сравнению с исходными данными, на 10-й и 20-й мин перфузии. Выводы. Полученные результаты позволяют сделать вывод о функциональной аналогии кардиотонического действия рекомбинантного аполипопротеина А-I по сравнению с его нативной формой. Однако механизм реализации инотропного эффекта требует дальнейшего изучения. Введение Возросший в настоящее время интерес исследователей к липопротеинам сыворотки крови в значительной степени обусловлен открытием разнообразных биологически важных внесосудистых свойств липопротеинов и их белковых компонентов — аполипопротеинов. В частности, установлена роль липопротеинов в стероидогенезе [1], раскрыты механизмы участия липопротеинов очень низкой плотности в комплексе со стероидными гормонами в усилении биосинтеза белка и дезоксирибонуклеиновой кислоты в опухолевых клетках [2], обнаружен контринсулярный эффект аполипопротеина В [3]. В последние годы опубликованы результаты исследований, показывающие защитное действие нативных липопротеинов высокой плотности и синтетических частиц, содержащих апоА-I, при повреждении миокарда в результате ишемии или реперфузии изолированного сердца крысы [4–6]. Ранее мы провели исследование влияния всех классов липопротеинов плазмы крови крыс на работу изолированного по Лангендорфу сердца крысы. В этих экспериментах постоянное и выраженное увеличение частоты и силы сердечных сокращений проявлялось у липопротеинов высокой плотности, которые устраняли негативное влияние адреналина на сердце при длительной перфузии [7]. В последующем на такой же модели обнаружено кардиотоническое действие аполипо­протеина А-I (апоА-I), полученного из крови доноров. В отличие от липопротеинов, аполипопротеин не влиял на частоту сокращений [8]. Изучение нативных белков плазмы крови связано с трудностями их получения в необходимых для исследования количествах. Развитие биотехнологии позволило решить эту проблему. В литературе представлены работы по реконструированию липопротеиновых частиц [4]. Проведен структурно-функциональный анализ целого ряда различных модификаций аполипопротеина А-I с целью выяснения механизмов их антиатерогенной активности [9]. Однако, как показали исследования, даже небольшие изменения в структуре апоА-I могут приводить к появлению патогенных свойств этого белка [10]. Данная работа посвящена исследованию полученного в НИИ биохимии рекомбинантного аполипопротеина А-I (рапоА-I) на показатели работоспособности изолированного сердца крысы с целью определения возможности данного протеина выступать в качестве кардиотонического соединения. Методы Эксперименты на лабораторных животных проводили в соответствии с приказом Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755 и приложение к приказу № 565 от 04.10.1977 г.) «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», согласно принципам Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2000 г.). Животные содержались на стандартной диете и имели свободный доступ к воде. Представленная работа одобрена комитетом по биоэтике НИИ биохимии № 5/1 от 14.11.2017 г. Работа выполнена на крысах-самцах Вистар массой 250–300 г. Исследования проведены на изолированном по Лангендорфу, сокращающемся сердце крысы по стандартной методике с регистрацией давления в левом желудочке. Перфузионное давление составило 60 мм рт. ст. Представленная работа является частью большого исследования, посвященного изучению роли липопротеинов высокой плотности и их основного белкового компонента аполипопротеина А-I в регуляции работы изолированного сердца [7, 8]. Более подробное методическое описание представлено в ранее опубликованной работе [8]. Определяли следующие показатели: частоту сердечных сокращений (ЧСС), коронарный поток (КП), давление в левом желудочке. Показатель работоспособности миокарда (Р) рассчитан как произведение давления на частоту сокращений в минуту. Отношение выполненной работоспособности к величине коронарного потока (Р/КП) определяло эффективность сократительной функции миокарда. Максимальную скорость увеличения давления (+dP/dt) и максимальную скорость падения давления (-dP/dt) мио­карда рассчитывали как отношение dP/dt [11]. Рекомбинантный аполипопротеин А-I (рапоА-I) человека был получен в клетках E. coli в виде химерного полипептида, с последующим превращением белка в зрелую форму рапоА-I. Проверка чистоты апоА-I осуществлялась с помощью электрофореза в 10% поли­акриламидном геле с Ds-Na. Белковые полосы визуализировали 0,1% Кумасси G-250 в смеси метанола и 10% уксусной кислоты (1:1). В качестве маркеров использовали набор низкомолекулярных белков-стандартов 10–80 кДа «Сибэнзим» (Россия), рис. 1. Подробно способ получения и очистки рапоА-I описан в нашей работе [12]. Фракцию, содержащую рапоА-I, разбавляли до 1 о.е./мл буфером, содержащим мочевину, и обессоливали диализом в фосфатно-солевом буфере. На заключительном этапе раствор белка стерилизовали фильтрованием, диаметр пор 0,22 мкм (Syringe-DivenFilters, Jet Biofilm, Корея), хранили при 4 °С и использовали в течение 3–5 дней. Концентрация обессоленного белка составляла 1,0 мг/мл. Дизайн Перфузию проводили в присутствии рапоА-I с концентрацией 20 мкг/мл. Количество животных в каждой группе составило восемь особей. Каждое выделенное сердце работало до установления стабильных показателей давления в левом желудочке и частоты сердечных сокращений без рециркуляции перфузионного давления. Время перфузии в условиях стабилизации показателей составило 15–20 мин. После этого проводили измерение исходных показателей (давление в левом желудочке, ЧСС, Р, Р/КП). Сердце работало в течение 30 мин. Данные работоспособности представлены для 5, 10, 20, 30 мин. Исходные (контрольные) показатели работы сердца крысы различались между собой, поэтому изменения в работе миокарда под влиянием изучаемых компонентов оценивали в процентах по отношению к исходным показателям [8]. Статистический анализ Проверку нормальности распределения данных в группах выполнили с помощью критерия Колмогорова – Смирнова. Корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента корреляции r-Спирмена. Дисперсию признака в выборках проверяли с помощью критерия F-Фишера. Статистическую значимость полученных результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок при уровне значимости p<0,05. Результаты Перфузия сердца раствором, содержащим рекомбинантный апоА-I, приводила к увеличению давления, развиваемому левым желудочком. Максимум эффекта приходился на 20-ю мин. При этом частота сердечных сокращений рактически не менялась (рис. 2). Этот результат согласуется с полученным ранее при использовании нативного аполипопротеина А-I в той же концентрации [8]. Анализ данных в динамике показал, что рекомбинант­ный апоА-I увеличивает давление в левом желудочке на пятой мин на 25% по сравнению с исходными данными (рис. 3, зеленая линия). Далее продолжается рост этого показателя и на 10-й мин увеличение составило 32,1%, а на 20-й мин отмечен максимум повышения на 47,5%, затем происходило плавное снижение, и на 30-й мин давление в левом желудочке увеличено на 35,7% относительно контроля. При этом частота сердечных сокращений оставалась на уровне исходных величин до 10 мин перфузии. К 20-й мин ЧСС увеличилась на 3,4%, а к 30-й мин на 7,4%. Однако эти изменения не имели статистически значимых отличий относительно контроля (рис. 3, синяя линия). Коронарный поток имел тенденцию к снижению, к 30-й мин составил 93% от исходных данных (рис. 3, красная линия). Полученные ранее данные в присутствии нативного апоА-I также показали максимальный прирост давления в левом желудочке на 20-й мин перфузии и незначительные изменения КП и частоты сердечных сокращений [8]. Интегральный показатель работоспособности (Р), определяемый как произведение ЧСС и давления в левом желудочке, возрос на 5-й мин до 125±5,90%, а к 20-й мин он достиг максимума и был выше на 53±4,18% по сравнению с исходным. Показатель эффективности работоспособности (Р/КП) имел схожую тенденцию. Отмечено увеличение Р/КП начиная с 5-й мин, на 20-й мин данный показатель выходил на максимум и составил 161,1% относительно исходного (рис. 4). По сравнению с Р, данные по изменению Р/КП были выше, это было опосредовано незначительным снижением коронарного потока (см. рис. 3). Установлено, что в присутствии рапоА-I увеличилась максимальная скорость сокращения левого желудочка (табл. 1). Начиная с 5-й мин перфузии происходило увеличение данного показателя. Наибольший эффект был зафиксирован на 20-й мин и составил 170,1% по сравнению с исходными значениями. К 30-й мин наблюдалось снижение максимальной скорости сокращения левого желудочка до 127,6%. При этом отмечен рост максимальной скорости расслабления левого желудочка. Здесь можно выделить два периода: 5–10-е мин и 20–30-е мин перфузии. В первом отрезке увеличение было в пределах 40%, во втором — около 60% по отношению к контролю. Показатель соотношения времени расслабления и сокращения указывает на уменьшение времени сокращения левого желудочка, что также говорит об усилении инотропного действия рапоА-I. При этом временной отрезок диастолы имел тенденцию к увеличению и был статистически значимо больше по сравнению с исходными данными на 10-й и 20-й мин перфузии (табл. 2). Обсуждение В настоящее время описано более 40 вариантов апоА-I с природной измененной функциональностью [13]. Одним из первых вариантов модификаций был апоА-I Милано (aпoA-I-М) [14]. В данном варианте мутации, в первичной структуре в 173-м положении Arg заменен на Cys. Носители варианта aпoA-I-М имеют очень низкий уровень холестерина, а также нормальный или умеренно повышенный уровень триглицеридов в плазме [15]. Показан благоприятный эффект инфузии рекомбинантного aпoA-I-М при восстановлении атеросклеротических поражений в экспериментальных моделях на животных, а также в клинических исследованиях для пациентов с ишемической болезнью сердца [16, 17]. В данной работе рекомбинантный апоА-I человека получен в клетках E. coli шт. BL21(DE3). Белок с молекулярной массой около 28 кДа не имеет двух аминокислотных остатков с N-конца (аспарагиновая и глутаминовая кислоты), в остальном по первичной структуре он идентичен нативному белку апоА-I человека. Такая модификация необходима и связана с оптимизацией количественного выхода рекомбинантного апоА-I [12]. В серии экспериментов показано, что рапоА-I по физико-химическим свойствам соответствует нативной форме апоА-I. Рекомбинантный апоА-I был исследован на способность проникать в ядра клеток гепатоцитов и оказывать влияние на скорость биосинтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты в комплексе с эстриолом. Результаты исследования показали способность конъюгата рапоА-I с изотиоцианатом флуоресцеина проникать в ядра гепатоцитов. Близкие значения скорости увеличения биосинтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты в изолированных гепатоцитах при влиянии комплексов рапоА-I-эстриол и апоА-I-эстриол указывали на функциональное сходство полученного рекомбинантного белка зрелой формы и нативного апоА-I человека [12]. Полученные нами данные на изолированном сердце показали, что рапоА-I оказывает выраженное инотропное действие, при этом ЧСС и коронарный поток изменяются незначительно. Сравнивая эти результаты с полученными ранее, можно утверждать, что рапоА-I по кардиотоническим свойствам соответствует нативной форме апоА-I [8]. Заключение Существование в организме соединений, схожих по механизму инотропного действия с гликозидами, — это вопрос с многолетней историей. Интерес к гликозидам связан прежде всего с их способностью усиления сократительной деятельности миокарда без значительного увеличения потребления энергии [18]. В литературе в качестве потенциальных инотропных агентов представлены вещества различной природы, в том числе и белковые соединения [19]. К последним относятся инсулин, глюкагон, адреномедуллин. Все они отличаются механизмами действия и спектрами вызываемых эффектов. Результаты наших исследований на изолированном сердце крысы позволяют с большой долей уверенности говорить об аполипопротеине А-I как о перспективном кардиотоническом средстве. Возможно, его эффект связан с активацией гликолитических процессов в миокарде. Ранее в НИИ биохимии показана способность липопротеинов высокой плотности усиливать гликолиз в скелетных мышцах [20]. Получение рекомбинантного апоA-I, воспроизводящего эффект нативного белка на изолированном по Лангендорфу сердце, дает возможность глубокого изучения механизма действия этого эндогенного соединения. Финансирование Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.

Keywords

• изолированное сердце
• инотропный препарат
• кардиотоническое действие
• рекомбинантный аполипопротеин А-I