COOPERAÇÃO DAS MUTAÇÕES CALR E TP53 NA TRANSFORMAÇÃO LEUCÊMICA DAS NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS

Abstract

Introdução: As Neoplasias Mieloproliferativas (NMPs) são caracterizadas por mutações driver nos genes JAK2, CALR ou MPL que levam à ativação constitutiva do eixo receptor de citocina JAK/STAT e mieloproliferação. A ocorrência de mutações somáticas, perda de heterozigosidade e/ou deleções no gene TP53 está associada a um maior risco de transformação para Leucemia Mieloide Aguda. Os mecanismos celulares e moleculares associados às mutações em TP53 e transformação leucêmica de NMP CALR -mutadas são pouco conhecidos. Nesse trabalho, usamos modelos de células tronco de pluripotência induzida (iPSC) para estudar a cooperação entre as mutações em CALR e TP53 nas NMPs. Métodos: Linhagens de iPSC de um indivíduo saudável (CALR wt) e de um paciente com NMP (CALR del52) foram editadas em TP53 usando CRISPR/Cas9. Para knockout (KO), foi utilizado um sgRNA específico para o exon 5 que foi clonado em um vetor expressando Cas9 e o marcador GFP. Para knock-in (KI) da mutação R175H, foi utilizado complexo RNP e plasmídeo com sequência doadora e marcador mCherry. Os clones foram triados por PCR e digestão enzimática e a edição foi analisada por sequenciamento. Para avaliar uma possível edição inespecífica, seis regiões potencialmente reconhecidas pelo sgRNA foram sequenciadas. Para verificar a expressão gênica das mutações geradas, o cDNA de TP53 (exons 4-7) foi sequenciado. Para avaliar a função de p53, as iPSCs foram tratadas com nutlina e a expressão da proteína foi analisada por Western Blot e a expressão dos genes alvos por qPCR. Para estudar o impacto das mutações na hematopoiese, foi realizada a diferenciação in vitro, seguida de análise das células hematopoiéticas por citometria de fluxo. Os progenitores hematopoiéticos obtidos foram avaliados em ensaio clonogênico e em cultura líquida, com análise das células hematopoiéticas após 7 dias por imunofenotipagem. Resultados: A partir de iPSC CALR wt e CALR del52 foram gerados clones com mutações in-frame ou frameshift em TP53 e clones CALR del52 TP53 R175H. Mutações in-frame e R175H estavam presentes em cDNA, enquanto as mutações frameshift não foram expressas. Modelos iPSC TP53wt tratados com nutlina mostraram estabilização e fosforilação de p53 e aumento na expressão dos genes alvo. No entanto, a função de p53 foi inibida em iPSCs TP53 -editadas. Inesperadamente, a proteína p53 não foi expressa em células com TP53 R175H resultando em um KO completo. Com relação à hematopoese, a mutação em CALR del52 acarretou o aumento de progenitores megacariocíticos, independentemente da edição de TP53. Nos ensaios clonogênicos, a edição de TP53 foi associada a um maior número de colônias mieloides no contexto CALR wt. Já nas iPSC CALR del52, p53KO levou ao aumento do número de colônias mieloides com presença de colônias CFU-GEMM e aumento do tamanho de colônias megacariocíticas. Além disso, em CALR del52/TP53 -editadas houve maior número de precursores megacariocíticos em cultura líquida, na ausência de trombopoetina. Conclusão: A cooperação das mutações CALR del52 e TP53 induz a amplificação de progenitores hematopoiéticos imaturos e potencializa a megacariopoiese. A modulação dos efeitos hematopoiéticos está inversamente correlacionada com o grau de inativação do TP53 no contexto CALR del52, com ausência completa de p53 exibindo o fenótipo mais marcado. No geral, nosso trabalho mostrou que a perda da função do p53 contribui para a desregulação da hematopoiese imatura.