NOCAUTE DO GENE BETA-2 MICROGLOBULINA EM CÉLULAS DERIVADAS DO TECIDO ADIPOSO UTILIZANDO O SISTEMA CRISPR/CAS9 PARA A GERAÇÃO DE PLAQUETAS HLA CLASSE I UNIVERSAIS

Abstract

A refratariedade é um problema recorrente no tratamento de pacientes trombocitopênicos que impede a restauração dos níveis normais de plaquetas circulantes após transfusões. Sua principal causa é a incompatibilidade entre os antígenos HLA Classe I das plaquetas transfundidas e os anticorpos do paciente. A produção de plaquetas in vitro a partir de células-tronco editadas geneticamente pode se tornar futuramente uma fonte de plaquetas universais. A linhagem de células-tronco/estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo (ASCL), ou adipócitos desdiferenciados (DFAT), são geradas a partir da desdiferenciação de adipócitos por meio do método “Ceiling Culture”, podem ser obtidas em abundância e diferenciar em megacariócitos e plaquetas em condições adequadas. Os antígenos HLA Classe I são fixados na superfície das células humanas por meio da ligação à proteína Beta-2 Microglobulina (B2M), expressa pelo gene B2M. Neste trabalho realizamos edição gênica em ASCL, obtendo populações carentes de antígenos HLA classe I, por meio de nocaute do gene B2M usando a ferramenta CRISPR/Cas9. Um RNA guia (sgRNA) foi projetado e sintetizado especificamente para quebra de DNA no éxon 2 do gene B2M. O sgRNA clonado no plasmídeo pL-CRISPR.EFS.GFP, foi sequenciado pelo método de sequenciamento automático de Sanger para confirmação. O plasmídeo clonado, juntamente com outros dois (segunda geração) para montagem de partículas lentivirais, foram transfectados em células HEK 293T e os lentivírus resultantes foram coletados e armazenados a -80°C até o uso. Diferentes lotes de lentivírus produzidos foram agrupados e utilizados em transduções de células K562 para a estimativa da produção lentiviral, quantificada através da detecção de proteína verde fluorescente (GFP) por citometria de fluxo. Células HEK 293T também foram usadas para testes iniciais de transdução e eficiência do nocaute usando três sgRNAs clonados e seus respectivos lentivírus, isoladamente ou em combinação. Os lentivírus portadores do plasmídeo clonado com sgRNA “guide#2”foram os mais eficazes na redução dos níveis de HLA Classe I na superfície das células HEK 293T e então escolhidos para a continuação do estudo. As transduções de ASCL, com MOI de aproximadamente 13,5 resultaram em populações de células viáveis e GFP positivas, sem antígenos HLA classe I. A maior redução foi observada no dia 7 pós-transdução, resultando em 96,4% de células negativas. Mais de 80% das células permaneceram negativas quando avaliadas nos dias 21 e 28. ASCL não editadas foram diferenciadas in vitro, originando megacariócitos e plaquetas, que foram caracterizados por microscopia óptica, citometria de fluxo normal e de imagem (anticorpos CD41, CD42b e CD61 e marcador nuclear Hoechst) e microscopia eletrônica de transmissão. No entanto, experimentos adicionais estão em andamento para comprovar a funcionalidade das plaquetas produzidas. A atual eficiência de transdução e nocaute do gene B2M usando CRISPR/Cas9, bem como a redução drástica dos níveis de antígenos HLA Classe I detectados na superfície das células ASCL nos permitirão armazenar as células modificadas em estado criogênico para posterior indução da diferenciação em plaquetas. Portanto, esta abordagem pode ser uma boa estratégia para gerar plaquetas funcionais, sem antígenos HLA Classe I.