جداسازی قارچ حل کننده فسفات از معدن فسفات و شناسائی مولکولی آن بر اساس توالی ژن کالمودولین

Abstract

سابقه و هدف: فسفر یکی از عناصر پرمصرف است و در بسیاری از فرآیندهای ضروری گیاه مانند تنفس، تقسیم سلولی، توسعه ریشه، فتوسنتز، تجزیه قند، نقل و انتقال مواد مغذی در داخل گیاه، انتقال خصوصیات ژنتیکی از یک نسل به نسل دیگر و تنظیم مسیرهای سوخت و ساز دخالت دارد. هنگامی‌که محتوای فسفر در خاک از 1/0% کمترگردد، کمبود رخ می‌دهد. امروزه جهت دستیابی به توسعه پایدار، استفاده از منابع طبیعی ارزان قیمت مغذی گیاهی مثل سنگ فسفات ضرورت دارد. در سال‌های اخیر استفاده از میکروارگانیسم‌های حل‌کننده فسفر جهت انحلال سنگ فسفات مورد مطالعه قرار گرفته است. هدف از این مطالعه، جداسازی قارچ‌های بومی دارای توانایی انحلال فسفر نامحلول و تعیین هویت موثرترین جدایه در سطح گونه بود. مواد و روش‌ها: از خاک اطراف معدن فسفر دلیر واقع در چالوس، (مازندران) نمونه‌برداری انجام شد. پس از تهیه سری رقت‌ها از سوسپانسیون خاک و انجام کشت در محیط‌های NBRIP-BPB و PVK کلنی‌های قارچی حل کننده فسفات جداسازی شدند. توانایی انحلال فسفات قارچ‌های جدا شده در محیط کشت مایع NBRIP نیز بررسی گردید. فسفر آزاد شده در محیط مایع و pH نمونه‌ها با استفاده از دستگاه pH‌متر اندازه‌گیری شد. جدایه‌ای که pH محیط را به میزان زیادی کاهش داد، فسفر بیشتری آزاد کرد و دارای شاخص انحلال بزرگتری بود، انتخاب شد. جدایه منتخب در ابتدا بر اساس توالی یابی ناحیه ITS مورد بررسی قرار گرفت و سپس شناسایی دقیق گونه با استفاده از تفاوت‌های مولکولی به‌دست آمده از توالی یابی ژن کالمودولین انجام شد. یافته‌ها: نتایج حاکی از آن است که استفاده از محیط کشت NBRIP-BPB نسبت به محیط کشت PVK برای جداسازی قارچ حل کننده فسفات مناسب‌تر است. غربالگری در محیط جامد و مایع برای هر یک از جدایه‌ها انجام گردید و جدایه SANRU به عنوان موثرترین جدایه در انحلال فسفات نامحلول انتخاب شد. نتایج حاصل از مقایسه توالی ژن ITS با توالی‌های موجود در بانک ژن نشان داد، سویه SANRU 100% با گونه‌های A.niger و A.tubingensis مشابهت دارد، به منظور غلبه بر این عدم اطمینان، بخشی از ژن کالمودولین تکثیر و توالی‌یابی گردید، تکثیر بخشی از توالی ژن کالمودولین نشان داد سویه SANRU متعلق به سکشن tubingensis است و نمونه تعیین توالی شده با شماره دسترسی KT222864 در بانک جهانی ژن ثبت گردید. نتیجه‌گیری: با توجه به نتایج حاصل از این بررسی غربالگری همزمان در محیط جامد و مایع برای تعیین توان انحلال فسفات، پیشنهاد می‌گردد. بنا به نتایج این مطالعه روش تعیین توالی ژن کالمودولین در مقایسه با ITS از دقت بسیار بالاتری برای تمایز گونه‌های آسپرژیلوس برخوردار است، لذا برای شناسایی دقیق آسپرژیلوس‌ها در حد گونه توصیه می‌شود.

Keywords

• آسپرژیلوس توبینجنسیس
• کالمودولین
• محیط کشت nbrip-bpb