DESENVOLVIMENTO DE UM NOVO SISTEMA BASEADO EM QPCR UTILIZANDO OS ALVOS MOLECULARES CYP141 E IS6110 PARA DETECÇÃO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Abstract

Introdução/objetivos: A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), que continua sendo um grave problema de saúde pública mundial. O diagnóstico convencional da TB é realizado pela análise dos critérios clínico-epidemiológicos do paciente, associados aos exames laboratoriais. Porém, ele apresenta inúmeras dificuldades, principalmente para os casos de TB extrapulmonar (TBEP), que podem vir acompanhados de outras doenças, apresentando sintomatologia inespecífica, e com amostras biológicas paucibacilares, o que compromete a sensibilidade dos métodos convencionais. Atualmente, o Xpert MTB/RIF é o único teste molecular recomendado pela OMS para o diagnóstico de TB. Porém, o Xpert MTB/RIF apresenta-se como uma técnica de alto custo, geralmente pode processar apenas quatro amostras simultaneamente e ainda não é eficaz para amostras TBEP. Nesse cenário, a PCR em tempo real (qPCR) in house é uma técnica rápida, precisa, de menor custo comparada ao Xpert MTB/RIF, e tem se mostrado promissora para o diagnóstico de TB. Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo desenvolver um sistema de qPCR in house utilizando os alvos moleculares IS6110-CyP141 para detecção de Mtb no diagnóstico laboratorial da TB. Métodos: Os primers e sondas dos genes alvo foram desenhados e analisados pela ferramenta OligoAnalyzer. Extração de DNA de cepas de referência H37Ra e H37Rv de Mtb foi realizada, seguida de diluição seriada 10 vezes com oito pontos de concentração de DNA (10ηg/µl – 1fg/µl) para e construção da curva padrão e determinar o limite de detecção. Os ensaios de qPCR in house foram realizados em triplicatas. Resultados: O limite de detecção do novo sistema de qPCR in house foi 100fg/µl (Ct 36) e 10fg/µl (Ct 34) para os genes CyP141 e IS6110, respectivamente, evidenciando uma maior sensibilidade para o alvo IS6110. As curvas de amplificação também foram menores para o gene IS6110 (Ct = 12 – 34) do que para o gene CyP141 (Ct = 17 – 36). Conclusão: Diante dos resultados preliminares, o novo sistema de qPCR in house (IS6110-CyP141) demonstrou bom desempenho de detecção da Mtb, possibilitando o diagnóstico precoce da doença nos pacientes com suspeita e início adequado do tratamento anti-TB. Além disso, a implementação do teste molecular in house usado concomitantemente com outras técnicas irá auxiliar os serviços de saúde do SUS no diagnóstico e controle da TB no país.

Keywords

• tuberculose pulmonar tuberculose extrapulmonar PCR em tempo real teste rápido molecular diagnóstico molecular