VacciMonitor (Aug 2014)
Evaluación de cuatro métodos de extracción del ADN de Histoplasmacapsulatum y su uso en reacciones de PCR
Abstract
Histoplasmacapsulatum es un hongo endémico de Cuba y el agente causal de la histoplasmosis. Esta micosis se presenta en forma de brotes epidémicos, afecta a las personas, independiente de su estado inmunológico. Su diagnóstico se realiza mediante técnicas microbiológicas, serológicas e histológicas que tienen una sensibilidad moderada y son demoradas. Por lo que se hace necesario la estandarización de métodos moleculares rápidos y eficientes para el diagnóstico de esta micosis. Se evaluaron cuatro métodos de extracción del ADN (enzimático, mecánico y dos químicos: tiocianato de guanidinio y Tritón X-100) a partir de una cepa de H. capsulatum en fase filamentosa. Se determinó la concentración, la pureza, el rendimiento y la integridad del ADN mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa. Se evaluaron dos técnicas de PCR con el ADN obtenido, con cebadores específicos de especie y otro con un cebador arbitrario. Los mejores resultados de concentración, pureza, rendimiento e integridad se obtuvieron con el método de extracción enzimático. Se logró la estandarización de las PCR con cebadores específicos, confirmándose así las 16 cepas estudiadas como H. capsulatum. Con el cebador arbitrario se amplificaron secuencias diferentes en las cepas ensayadas. Se demostró que el método de extracción enzimática brindó un ADN de buena calidad para su utilización en PCR. Este trabajo facilita el diagnóstico rápido y confiable de H. capsulatum en Cuba y brinda la posibilidad de identificar cepas con estructuras relacionadas genéticamente con los marcadores de patogenicidad y la virulencia, útiles para conformar un inmunógenovacunal.
